Tα αποτελέσματα του έργου θα είναι διαθέσιμα δωρεάν για όλες τις επιχειρήσεις που δραστηριοποιούνται στον συγκεκριμένο τομέα.
Ε.Ε.1. Στόχος: Ανάπτυξη μεθοδολογίας.
Διάρκεια: 0-38 μήνες
Περιγραφή: Στην ενότητα αυτή αναπτύσσονται μέθοδοι για τον προσδιορισμό και την ταυτοποίηση του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού Φ.O. με UPLC/MS-MS όσο και εύχρηστες μέθοδοι που θα επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πλέον γνωστών ΦΟ.
Παραδοτέα:
Π.1.3 Μέθοδοι που επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πλέον γνωστών φυτοοιστρογόνων
Η υλοποίηση του Παραδοτέου 1.3 στοχεύει στην ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού μικρού αριθμού φυτοοιστρογόνων με εύχρηστες μεθόδους υγρής χρωματογραφίας υψηλής ακρίβειας (HPLC). Οι μέθοδοι περιλαμβάνουν τη χρήση διαφορετικών ανιχνευτών, όπως ηλεκτροχημικό (ECD), υπεριώδους ακτινοβολίας (UV), φθορισμομετρικό (FL) και συστοιχίας διόδων (DAD). Επιλέχθηκαν φυτοοιστρογόνα που προσδιορίστηκαν κατά την υλοποίηση του Παραδοτέου 1.2 και συγκεκριμένα γενιστεΐνη, δαϊζδεΐνη, βιοχανίνη Α, φορμονετίνη και γλυσιτεΐνη. Οι παραπάνω ενώσεις περιέχονται κυρίως σε ιχθυοτροφές που έχουν υποστεί αντικατάσταση ιχθυάλευρου και ιχθυέλαιου από φυτικές πρώτες ύλες.
Η διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος παρουσίασε υψηλό βαθμό απλότητας, λόγω του χαμηλού κόστους των αντιδραστηρίων και της ταχύτητας παρασκευής. Όλες οι ενώσεις ανιχνεύθηκαν, χωρίς την ανάγκη υψηλής παραμετροποίησης του προγράμματος έκλουσης.
Το όριο ποσοτικοποίησης για όλες τις ενώσεις ήταν στην περιοχή των 5 μg/mL στην περίπτωση του ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) στα 250 nm. Ταυτόχρονα ο ανιχνευτής συστοιχίας διόδων (DAD) κάλυψε και το εύρος μηκών κύματος, στο οποίο λειτουργεί ο ανιχνευτής UV ακτινοβολίας. Η χρήση της (DAD), επέτρεψε την ανίχνευση και τη ποσοτικοποίηση τους με τα όρια ανίχνευσης να είναι 1.6 μg/mL έως 3.7 μg/mL. Και τα όρια ποσοτικοποίηση ήταν από 2 μg/mL έως 10 μg/mL.
Στην περίπτωση του ανιχνευτή ECD, η δαϊδζεΐνη και η γλυσιτεΐνη ανιχνεύθηκαν ικανοποιητικά σε δυναμικό +0.75V (όριο ανίχνευσης 10 και 15 μg/mL αντίστοιχα). Για την ανίχνευση της φορμονονετίνης και της βιοχανίνης-Α απαιτήθηκε αλλαγή σε δυναμικό υψηλότερο των +1.2V, όπου η διατήρηση της σταθερότητας της βασικής γραμμής είναι προβληματική.
Στην περίπτωση της μεθόδου UV επαναλήφθησαν τα πειράματα σε δείγμα σόγιας και ιχθυοτροφή και με τη δεύτερη μέθοδο εκχύλισης ώστε να ελεγχθεί η πιστότητά της και να συγκριθεί με την μέθοδο DAD. Τα αποτελέσματα και των δύο πειραμάτων ήταν αντίστοιχα.
Π.1.4. Μέθοδος (ELISA) προσδιορισμού της βιτελλογενίνης στο πλάσμα ιχθύων.
Στo πλαίσιο του έργου με τίτλο «Ανάπτυξη και σύγκριση μεθοδολογιών ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού Φυτοοιστρογόνων σε πρώτες ύλες ιχθυοτροφών, ιχθυοτροφές και εκτρεφόμενα Μεσογειακά είδη ιχθύων» και ακρωνύμιο EstroFish, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μεθόδου ELISA προκειμένου να διερευνηθεί η οιστρογονική δράσης των φυτοοιστρογόνων (ΦΟ) στην τσιπούρα (Sparus aurata) και στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax). Τα Φ.Ο. έχουν τη δυνατότητα να λειτουργούν ως ενδοκρινικοί αποσταθεροποιητικοί παράγοντες προκαλώντας ποικίλες ορμονικές διαταραχές, όπως είναι η μεταβολή της αναλογίας του φύλου (sex ratio) και η σημαντική αλλαγή των επιπέδων της βιτελλογενίνης στο πλάσμα ή το ήπαρ των ιχθύων. Στην επιλεγμένη μέθοδο Δοκιμής ενζυμικής ανοσοαπορρόφησης (ELISA) χρησιμοποιήθηκε κιτ μέτρησης της βιτελλογενίνης σε ιχθύς, έγιναν οι απαραίτητες δοκιμές και προσαρμογές με χρήση δύο διαφορετικών πολυκλωνικών αντισώματων: Rabbit anti-Sea Bream Vtg Polyclonal antibody και Rabbit VTG Sole Vittellogenin polyclonal antibody. Στο παρόν παραδοτέο, αναπτύσσεται το πρωτόκολλο της μεθόδου και τα απαραίτητα υλικά. Τα πειραματικά δεδομένα των ανάλυση των δειγμάτων από τις πειραματικές εκτροφές τσιπούρας και λαβρακιού παρουσιάζονται στο Π.3.3 και η αποτίμηση της επίδρασής των Φ.Ο. στην ανάπτυξη και στην φυσιολογία των εκτρεφόμενων ιχθύων με την εκτίμηση των επιπέδων της βιτελλογενίνης, παρουσιάζονται στο Π.4.6.
Ε.Ε.2. Πειραματική Εκτροφή
Διάρκεια: 3-40 μήνες
Παραδοτέα:
Π.2.1. Σύσταση πειραματικών ιχθυοτροφών
Στο πλαίσιο του έργου με τίτλο «Ανάπτυξη και σύγκριση μεθοδολογιών ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού φυτοοιστρογόνων σε πρώτες ύλες ιχθυοτροφών, ιχθυοτροφές και εκτρεφόμενα Μεσογειακά είδη ιχθύων» και ακρωνύμιο EstroFish, έλαβανχώρα πειραματικές εκτροφές τσιπούρας (Sparus aurata) και λαβρακιού (Dicentrarchus labrax). Στο παρόν παραδοτέο, δίνεται η χημική σύσταση των ιχθυοτροφών (πρωτεΐνες, λίπη, υγρασία, τέφρα, υδατάνθρακες), που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις εντατικές εκτροφές τσιπούρας και λαβρακιού σε συστήματα υδατοκαλλιέργειας με επανακυκλοφορία, που πραγματοποιήθηκαν στο στο πλαίσιο του παραπάνωέργου. Επίσης, παρατίθεται η σύσταση του λίπους αυτών των τροφών σε λιπαρά οξέα. Συγκεκριμένα, για τους πειραματισμούς της τσιπούρας χρησιμοποιήθηκαν δύο ιχθυοτροφές, που επιλέχθηκαν μετά από screening των διαθέσιμων τροφών στο εμπόριο με βάση τη σύσταση τους σε φυτοοιστρογόνα και θρεπτκά συστατικά. Oι δύο ιχθυοτροφές, Α και Β, ήταν ισοενεργειακές και ισοαζωτούχες (ισοπρωτεϊνικές). Συγχρόνως, η ιχθυοτροφή Α είχε υψηλότερη περιεκτικότητα σε φυτοοιστρογόνα σε σχέση με την τροφή Β. Στην ιχθυοτροφή Α η συμμετοχή πρώτων υλών φυτικής προέλευσης ήταν μεγαλύτερη από ότι στην τροφή Β, και ως αποτέλεσμα παρουσίασε υψηλότερη περιεκτικότητα σε τέφρα και χαμηλότερη σε λίπος. Για τους πειραματισμούς σε λαβράκι, ακολουθήθηκε η προσέγγιση της μελέτης της συνδυασμένης δράσης φυτοοιστρογόνων και λιπαρών οξέων. Γι’ αυτό το λόγο χρησιμοποιήθηκαν τροφές που προήλθαν από την προσθήκη διαφορετικών μειγμάτων ελαίων σε βασική τροφή με υψηλή συμμετοχή σογιάλευρου. Πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματικές εκτροφές. Στην πρώτη εξετάστηκαν δύο τροφές που παρασκευάστηκαν με προσθήκη ελαίου ελαιοκράμβης (RO) και μίγματος ελαίων ελαιοκράμβης και σόγιας (RO-SBO) αντίστοιχα. Για τη δεύτερη πειραματική εκτροφή η βασική τροφή ελαιώθηκε με ιχθυέλαιο (FO) και με σογιέλαιο (SBO) αντίστοιχα.
Π.2.2. Χαρακτηριστικά ανάπτυξης τσιπούρας και λαβρακιού.
Στο παραδοτέο Π.2.2, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των χαρακτηριστικών ανάπτυξης που προέκυψαν από εντατικές εκτροφές τσιπούρας Sparus aurata και λαβρακιού Dicentrarchus labrax, οι οποίες αποτέλεσαν τμήματα των πειραματισμών του έργου. Οι εκτροφές έλαβαν χώρα σε συστήματα υδατοκαλλιέργειας με επανακυκλοφορία του Εργαστηρίου Εφηρμοσμένης Υδροβιολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Στην περίπτωση της τσιπούρας, οι ιχθύες, κατά τη διάρκεια των δύο πειραματικών εκτροφών, διατράφηκαν με δύο ιχθυοτροφές που διέφεραν ως προς την περιεκτικότητα τους σε φυτοοιστρογόνα και δοκιμάστηκαν σε άτομα διαφορετικού σωματικού βάρους (S και L εκτροφή). Στόχος ήταν η εκτίμηση της επίδρασης των φυτοοιστρογόνων στα διαφορετικά στάδια της εκτροφής. Για την εκτροφή του λαβρακιού ακολουθήθηκε η προσέγγιση της μελέτης της συνδυασμένης δράσης φυτοοιστρογόνων και λιπαρών οξέων. Γι’ αυτό το λόγο παρασκευάστηκε μία βασική τροφή και ακολούθως προστέθηκαν διαφορετικών μειγμάτων ελαίων. Χρησιμοποιήθηκαν σογιέλαιο (SBO), κραμβέλαιο (RO) και ιχθυέλαιο (FO). Πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματικές εκτροφές. Στην πρώτη συγκρίθηκαν οι επιδράσεις μεταξύ τροφής με RO και τροφή με μείγμα SBO-RO. Στη δεύτερη συγκρίθηκε η τροφή με FO με την τροφή με SBO. Η διάρκεια κάθε εκτροφής ήταν τρεις μήνες. Στο τέλος κάθε πειραματικής περιόδου, πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία για τον προσδιορισμό των παραμέτρων ανάπτυξης (σωματικό βάρος, ολικό, σταθερό και μεσουραίο μήκος, σπλαχνοσωματικός και ηπατοσωματικός δείκτης, συντελεστής ευρωστίας, ειδικός ρυθμός ανάπτυξης, συντελεστής εκμετάλλευσης της τροφής, αποδοτικότητα της τροφής, συντελεστής θερμικής ανάπτυξης, ημερήσιος ρυθμός ανάπτυξης). Στην τσιπούρα το διαφορετικό φυτοοιστρογονικό περιεχόμενο των τροφών, φάνηκε να μην επηρεάζει στατιστικά σημαντικά τις παραμέτρους ανάπτυξης στην εκτροφή (S) χαμηλού αρχικού σωματικού βάρους. Στην εκτροφή (L) με το μεγαλύτερο αρχικό σωματικό βάρος, η τροφή με την υψηλή συγκέντρωση φυτοοιστρογόνων παρουσίασε στατιστικά σημαντική μείωση του σπλαχνοσωματικού και ηπατοσωματικού δείκτη και μία τάση για μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης της τσιπούρας. Στον πειραματισμό στο λαβράκι, όπου η παρουσία φυτοοιστρογόνων στην τροφή συνδυάστηκε με διαφορετική σύσταση λιπαρών οξέων, φαίνεται να μην υπάρχει ξεκάθαρη επίδραση στις παραμέτρους ανάπτυξης. Η σόγια (πλούσια σε Φ/Ο) αποτέλεσε σημαντική πρώτη ύλη στον πειραματισμό με το λαβράκι, προκειμένου να υπάρξει σημαντική παρουσία φυτοοιστρογόνων στη βασική τροφή. Όταν αυτή συνδυάστηκε με σογιέλαιο, ως κύριο συστατικό του μείγματος ελαίωσης της τροφής παρουσιάστηκε τάση μείωσης του βάρους των σπλάχνων του λαβρακιού. Οι τάσεις μειωμένων σωματομετρικών παραμέτρων (ΜΣ) που παρουσιάστηκαν σε άτομα που είχαν εκτραφεί με το σιτηρέσιο SBO, είναι πιθανό να συμβάλουν στην πληρέστερη ερμηνεία των αποτελεσμάτων των αιματολογικών αναλύσεων. Τα αποτελέσματα του παρόντος παραδοτέου θα αξιολογηθούν μαζί τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των επιπέδων των λιπιδίων και λιπαρών οξέων στο ήπαρ και το φιλέτο (Π2.4), ώστε να καταστεί πληρέστερη η διερεύνηση της επίδρασης των φυτοοιστρογόνων στους εκτρεφόμενους ιχθύς.
Π.2.3.Επίπεδα λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα τσιπούρας και λαβρακιού.
Στο πλαίσιο του έργου, πραγματοποιήθηκαν δύο τρίμηνες εκτροφές τσιπούρας διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης (S και L) με χρήση δύο τροφών με διαφορετική περιεκτικότητα σε φυτοοιστρογόνα με και δύο εκτροφές λαβρακιού με τη χρήση τεσσάρων διαφορετικών ελαίων όπως περιγράφονται στο Π.2.2. Μετά το πέρας κάθε εκτροφής λήφθηκαν δείγματα αίματος ιχθύωναπό κάθε χειρισμό. Στο πλάσμα του αίματος προσδιορίστηκαν τα τριγλυκερίδια, η ολική, η LDL και η HDL χοληστερόλη. Συμπληρωματικά πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της αλβουμίνης (ALB), της γλυκόζης (GLU), της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), της γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH), της αλανινικής αμινοτρανσφεράσης (GPT) και της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (GOT). Στην εκτροφή S δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των παραπάνω παραμέτρων. Στην εκτροφή L παρατηρήθηκαν σημαντικά αυξημένες συγκεντρώσεις ολικής χοληστερόλης, τριγλυκεριδίων και LDL χοληστερόλης στα άτομα της διατροφικής επέμβασης με τη χαμηλή συγκέντρωση φυτοοιστρογόνων. Στις εκτροφές λαβρακιού παρατηρήθηκε ότι με τη χρήση δύο ιχθυοτροφών με έλαιο σόγιας SΒO και με ιχθυέλαιο FO αντίστοιχα. παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση των TG στα άτομα που διατράφηκαν με FO. Επιπλέον, η τροφή SΒO φαίνεται να μειώνει τα επίπεδα LDL και ALB. Τα αποτελέσματα των βιοχημικών αναλύσεων που έγιναν κατά τον δεύτερο πειραματισμό με τη χρήση δύο ιχθυοτροφών με έλαιο ελαιοκράμβης RO και μείγμα ελαίων σόγιας και ελαιοκράμβης SΒO-RO αντίστοιχα, έδειξαν ότι τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων παρουσίασαν στατιστικά σημαντική μείωση στην ομάδα των ιχθύων που κατανάλωσαν την τροφή RO. Παράλληλα, οι ιχθύες που κατανάλωσαν την τροφή SBO-RO παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα ALP και μειωμένα επίπεδα HDL. Από τα αποτελέσματα και την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας συμπεραίνεται η ανασταλτική δράση των φυτοοιστρογόνων στη αύξηση της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων στη τσιπούρα. Στο λαβράκι το είδος φυτικών ελαίων που χρησιμοποιήθηκε στις εκτροφές έχει διαφορετική επίδραση στα επίπεδα των αιματολογικών παραμέτρων που σχετίζονται με το μεταβολισμό του λίπους με την παρουσία του SBO να σχετίζεται με αύξηση των TG και μείωση των HDL και LDL.
Π.2.4. Περιεκτικότητα σε λίπος του ήπατος και φιλέτου τσιπούρας και λαβρακιού.
Στο πλαίσιο του έργου, έλαβαν χώρα πειραματικές εκτροφές τσιπούρας (Sparus aurata) και λαβρακιού (Dichentrarchus labrax). Στην περίπτωση της τσιπούρας, οι ιχθύες, κατά τη διάρκεια των δύο πειραματικών εκτροφών, διατράφηκαν με δύο ιχθυοτροφές που διέφεραν ως προς την περιεκτικότητα τους σε φυτοοιστρογόνα και δοκιμάστηκαν σε άτομα διαφορετικού σωματικού βάρους (S και L εκτροφή). Στόχος ήταν η εκτίμηση της επίδρασης των φυτοοιστρογόνων στα διαφορετικά στάδια της εκτροφής. Για την εκτροφή του λαβρακιού ακολουθήθηκε η προσέγγιση της μελέτης της συνδυασμένης δράσης φυτοοιστρογόνων και λιπαρών οξέων. Γι’ αυτό το λόγο παρασκευάστηκε μία βασική τροφή και ακολούθως προστέθηκαν διαφορετικών μειγμάτων ελαίων. Χρησιμοποιήθηκαν σογιέλαιο (SBO), κραμβέλαιο (RO) και ιχθυέλαιο (FO). Πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματικές εκτροφές. Στην πρώτη συγκρίθηκαν οι επιδράσεις μεταξύ τροφής με RO και τροφή με μείγμα SBO-RO. Στη δεύτερη συγκρίθηκε η τροφή με FO με την τροφή με SBO. Μετά το πέρας κάθε εκτροφής λήφθηκαν δείγματα ιστών και πιο συγκεκριμένα ήπατος και φιλέτου, στα οποία προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα σε λίπος, καθώς και η σύσταση του λίπους σε λιπαρά οξέα.
Στις πειραματικές εκτροφές τσιπούρας, το μέσο αρχικό βάρος για το 1ο πείραμα ήταν 55,58±0,55g (εκτροφή S) και για το 2ο ήταν 101,37±0,78g (εκτροφή L). Σε κάθε πείραμα χορηγήθηκαν 2 τροφές, Α και Β, με διαφορετικό περιεχόμενο σε φυτοοιστρογόνα. Η τροφή Α με το υψηλότερο περιεχόμενο σε φυτοοιστρογόνα προκάλεσε μείωσε του λίπους στο ήπαρ των ατόμων της L εκτροφής σε σχέση με την τροφή Β. Επίσης, η τροφή Α επέφερε αύξηση της περιεκτικότητας (% των ολικών λιπαρών οξέων) σε EPA, DHA και n-3 LC-PUFA στο λίπος του ήπατος, αλλά μείωση αυτών στο λίπος του φιλέτου, στις τσιπούρες και των δύο πειραμάτων.
Στις πειραματικές εκτροφές λαβρακιού, το μέσο αρχικό βάρος για την εκτροφή RO vs SBO-RO ήταν 96.00±0.437 g και για την εκτροφή FO vs SBO ήταν 95.58±0.663 g. Η παρουσία φυτοοιστρογόνων στην τροφή σε συνδυασμό με τη διαφορετική σύσταση του λίπους των τροφών σε λιπαρά οξέα, φαίνεται να μην επιδρούν καθοριστικά στην αύξηση και στη χημική σύσταση των ιχθύων. Επίσης, η σύσταση του λίπους του φιλέτου και του ήπατος σε λιπαρά οξέα, φάνηκε να ακολουθεί την αντίστοιχη σύσταση της κάθε πειραματικής τροφής.
Π.2.5. Παραλαβή δειγμάτων ήπατος και φιλέτου για ανάλυση φυτοοιστρογόνων
Στο πλαίσιο του έργου, έλαβαν χώρα πειραματικές εκτροφές τσιπούρας (Sparus aurata) και λαβρακιού (Dichentrarchus labrax) με τη χρήση εμπορικών τροφών, οι οποίες θα διαφοροποιούνται ως προς τις εναλλακτικές πηγές πρωτεΐνης και λίπους που έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μερική αντικατάσταση του ιχθυαλεύρου και του ιχθυελαίου αντίστοιχα. Στο τέλος κάθε πειραματισμού πραγματοποιήθηκε η λήψη δειγμάτων ήπατος και φιλέτου προκειμένου να προσδιοριστούν στη συνέχεια η περιεκτικότητα τους σε λίπος αλλά και σε φυτοοιστρογόνα.
Στο παρόν παραδοτέο (Π.2.5.), περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία παραλαβής δειγμάτων ήπατος και φιλέτου τσιπούρας Sparus aurata και λαβρακιού Dichentrarchus labrax, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για αναλύσεις προσδιορισμού φυτοοιστρογόνων. Τα δείγματα προέρχονται από τσιπούρες και λαβράκια, οι οποίες εκτράφηκαν σε ανακυκλούμενα συστήματα υδατοκαλλιέργειας το Εργαστηρίου Εφηρμοσμένης Υδροβιολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματικές εκτροφές τσιπούρας, με άτομα διαφορετικού σταδίου ανάπτυξης. Για τη διατροφή των ιχθύων χρησιμοποιήθηκαν δύο ιχθυοτροφές στις οποίες είχε γίνει αντικατάσταση του ιχθυαλεύρου και του ιχθυελαίου με φυτικές πρώτες ύλες, που συνήθως χρησιμοποιούνται στη βιομηχανία. Επιπλέον, οι τροφές διέφεραν ως προς την περιεκτικότητα τους σε φυτοοιστρογόνα. Όσον αφορά το λαβράκι πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματικές εκτροφές στις οποίες έγινε ελαίωση μιας βασικής εμπορικής τροφής με τέσσερα διαφορετικά έλαια. Για τις δύο μεταχειρίσεις του πρώτου πειραματισμού χρησιμοποιήθηκε έλαιο ελαιοκράμβης (RO) και μίγμα ελαίων ελαιοκράμβης και σόγιας (SBO-RO) αντίστοιχα. Για τις δύο μεταχειρίσεις του δεύτερου πειραματισμού η βασική τροφή ελαιώθηκε με ιχθυέλαιο (FO) και με σογιέλαιο (SBO) αντίστοιχα.Η χημική σύσταση όλων των πειραματικών τροφών τροφής δίνεται στο παραδοτέο Π.2.1 και η περιεκτικότητα αυτών σε φυτοοιστρογόνα στο παραδοτέο Π.3.2. Οι συνθήκες πειραματικής εκτροφής περιγράφονται στο παραδοτέο Π.2.2. Η μέθοδος που επιλέχθηκε για τον προσδιορισμό των φυτοοιστρογόνων στο ήπαρ και στο φιλέτο των ιχθύων περιγράφεται στο παραδοτέο Π.1.3. Τέλος, παρουσιάζονται αναλυτικά τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τη λήψη δειγμάτων ήπατος και φιλέτου και περιγράφονται συνοπτικά οι μελλοντικές εργασίες που ακολούθησαν.
Π.2.6.Παραλαβή δειγμάτων πλάσματος για ανάλυση βιτελλογενίνης
Στο παρόν παραδοτέο, περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία παραλαβής δειγμάτων πλάσματος τσιπούρας Sparus aurata , και λαβρακιού Dicentrarchus labrax τα οποία προορίζονται για αναλύσεις προσδιορισμού βιτελλογενίνης. Τα δείγματα τσιπούρας προέρχονται από δύο τρίμηνες εκτροφές τσιπούρας διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης (S και L), οι οποίες αναπτύχθηκαν σε ανακυκλούμενο σύστημα υδατοκαλλιέργειας το Εργαστηρίου Εφηρμοσμένης Υδροβιολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Επιπλέον οι τροφές διέφεραν ως προς την περιεκτικότητα τους σε φυτοοιστρογόνα. Τα δείγματα λαβρακιού προέρχονται από δύο τρίμηνες εκτροφές λαβρακιού σε ανακυκλούμενο σύστημα υδατοκαλλιέργειας το Εργαστηρίου Εφηρμοσμένης Υδροβιολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Σε όλες τις εκτροφές λαβρακιού χρησιμοποιήθηκε η ίδια βασική τροφή η οποία για τον τις δύο μεταχειρίσεις του πρώτου πειραματισμού ελαιώθηκε με έλαιο ελαιοκράμβης (RO) και με μίγμα ελαίων ελαιοκράμβης και σόγιας (SBO-RO), ενώ για τις δύο μεταχειρίσεις του δεύτερου πειραματισμού ελαιώθηκε με ιχθυέλαιο (FO) και με σογιέλαιο (SBO) αντίστοιχα. Η χημική σύσταση των τροφών τόσο για τους πειραματισμούς της τσιπούρας όσο και για τους πειραματισμούς του λαβρακιού δίνεται στο παραδοτέο Π.2.1 και η περιεκτικότητα αυτών σε φυτοοιστρογόνα στο παραδοτέο Π.3.2. Οι συνθήκες των πειραματικών εκτροφών περιγράφονται στο παραδοτέο Π.2.2. Στο παρόν Παραδοτέο, παρουσιάζονται αναλυτικά τα υλικά και οι διαδικασίες που χρησιμοποιήθηκαν για τη λήψη δειγμάτων αίματος και την απομόνωση του πλάσματος, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της βιτελλογενίνης.
Ε.Ε. 3. Στόχος: Εργαστηριακός Πειραματισμός
Διάρκεια:6-40 μήνες
Περιγραφή: Στο τρίτο στάδιο εντάσσονται, τόσο οι εκχυλίσεις σε άλευρα, έλαια και ιχθυοτροφές όσο και σε ιχθύες. Στις ιχθυοτροφές θα συμπεριλαμβάνονται και οι τροφές που θα χρησιμοποιηθούν για την εκτροφή (ΕΕ2). Θα ακολουθήσει η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των ΦΟ με τη τεχνική UPLC-MS/MS (στο σύνολο των εκχυλισμάτων) και τις εύχρηστες τεχνικές (σε προεπιλεγμένα εκχυλίσματα αλεύρων, ελαίων και ιχθυοτροφών). Με την ίδια μεθοδολογία (UPLC-MS/MS) θα μελετηθούν και τα εκχυλίσματα ιστών ιχθύων.
Παραδοτέα:
Π.3.4. Αναλύσεις βιτελλογενίνης σε πλάσμα ιχθύων. Έκθεση αποτελεσμάτων.
Στο πλαίσιο του έργου, αναπτύχθηκε μέθοδος ενζυμικού προσδιορισμού ELISA για τη μελέτη της επίδρασης της οιστρογονικής δράσης των φυτοοιστρογόνων (ΦΟ) στα επίπεδα βιτελλογενίνης στην τσιπούρα και το λαβράκι. Η μεθοδολογία αυτή εφαρμόστηκε σε δείγματα που λήφθηκαν από δυο εκτροφές τσιπούρας και δύο εκτροφές λαβρακιού όπως περιγράφονται αναλυτικά στο Π.2.6. Η επίδραση των τροφών στα επίπεδα βιτελλογενίνης διερευνήθηκε σε δύο διαφορετικά στάδια ανάπτυξης της τσιπούρας (S και L). Στις εκτροφές λαβρακιού χρησιμοποιήθηκε η ίδια εμπορική τροφή (βασική τροφή) οι οποία σε κάθε χειρισμό είχε εμπλουτιστεί με διαφορετικά έλαια. Για τις δύο μεταχειρίσεις του πρώτου πειραματισμού συγκρίθηκαν οι χειρισμοί με τις τροφές που είχαν εμπλουτιστεί με έλαιο ελαιοκράμβης (RO) και μίγμα ελαίων ελαιοκράμβης και σόγιας (SBO-RO) αντίστοιχα, ενώ στην δεύτερη εκτροφή συγκρίθηκαν οι τροφές που είχαν ελαιωθεί με ιχθυέλαιο (FO) και με σογιέλαιο (SBO) αντίστοιχα. Για τη ανίχνευση των επιπέδων βιτελλογεννίνης στο πλάσμα των ιχθύων επιλέχθηκε η μέθοδος ELISA με τη χρήση δύο διαφορετικών πολυκλωνικών αντισώματων: Rabbit anti-Sea Bream Vtg Polyclonal antibody και Rabbit VTG Sole Vittellogenin polyclonal antibody. Στο παρόν παραδοτέο, παρουσιάζονται τα πειραματικά δεδομένα και τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της μεθόδου καθώς και η στατιστική επεξεργασία των δειγμάτων ιχθύων από τις εκτροφές τσιπούρας και λαβρακιού. Στα άτομα τσιπούρας εμφανίζονται στατιστικά σημαντικές διαφορές μόνο στα άτομα με μεγαλύτερο αρχικό σωματικό βάρος (εκτροφή L), υποδεικνύοντας ότι φάση ανάπτυξης των ιχθύων είναι σημαντικός παράγοντας στην επίδραση των φυτοοιστρογόνων σε σχέση με την παραγωγή της βιτελλογενίνης. Αντίθετα στις εκτροφές των λαβρακιών δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές ανεξαρτήτως χειρισμού. Η σημασία της επίδρασής των ΦΟ στα επίπεδα επιπέδων της βιτελλογενίνης, παρουσιάζεται αναλυτικά στο Π.4.6.
Ε.Ε. 4. Στόχος: Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων
Διάρκεια:0-40 μήνες
Περιγραφή: Η ενότητα αυτή αφορά στην αξιολόγηση και τη σύνδεση των αποτελεσμάτων των προηγούμενων ΕΕ και τη σύγκριση με βιβλιογραφικά δεδομένα.
Παραδοτέα:
Π.4.4. Επίδραση των διατροφικών ΦΟ στην ανάπτυξη και τον μεταβολισμό του λίπους των ιχθύων.
Στο πλαίσιο του έργου, πραγματοποιήθηκαν δύο τρίμηνες εκτροφές τσιπούρας διαφορετικών σταδίων ανάπτυξης (S και L) με χρήση δύο τροφών με διαφορετική περιεκτικότητα σε φυτοοιστρογόνα με και δύο εκτροφές λαβρακιού με τη χρήση μιας κοινής βασικής τροφής η οποία ελαιώθηκε με τη χρήση τεσσάρων διαφορετικών ελαίων (Π.2.1., Π.2.2) Μετά το πέρας κάθε εκτροφής αξιολογήθηκαν οι δείκτες ανάπτυξης των εκτρεφόμενων ψαριών (Π.2.4) και λήφθηκαν δείγματα φιλέτου, ήπατος και αίματος (Π.2.3.). Στο φιλέτο και στον ιστό των ιχθύων πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις προσδιορισμού της περιεκτικότητάς τους σε λίπους αλλά και αναλύσεις προσδιορισμού της σύστασής τους σε λιπαρά οξέα. Στο πλάσμα του αίματος προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των λιπιδίων και των λιποπρωτεϊνών (Π.2.3). Παράλληλα εντοπίστηκαν οι μεταβολίτες (φυτοοιστρογόνα και φυτοστερόλες) στις ιχθυοτροφές που χρησιμοποιήθηκαν, στους ιστούς και το ήπαρ των ατόμων της εκτροφής (Π.4.5.). Στο παρόν παραδοτέο ακολουθεί η συνδυαστική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των ΕΕ2, ΕΕ3 και ΕΕ4 τα δεδομένα α προκειμένου να εκτιμηθεί η επίδραση των φυτοοιστρογόνων στην ανάπτυξη και στον μεταβολισμό του λίπους των εκτρεφόμενων μεσογειακών ιχθύων.
Π.4.6. Σχέση επιπέδων διατροφικών ΦΟ και συγκεντρώσεων βιτελλογενίνης στο πλάσμα των ιχθύων.
Στο πλαίσιο του έργου, αναπτύχθηκε μέθοδος ενζυμικού προσδιορισμού ELISA για τη μελέτη της επίδρασης ανάπτυξη μεθόδου διερεύνησης της οιστρογονικής δράσης των ΦΟ στην τσιπούρα και το λαβράκι. Τα Φ.Ο. αυτά έχουν τη δυνατότητα να λειτουργούν ως ενδοκρινικοί αποσταθεροποιητικοί παράγοντες προκαλώντας ποικίλες ορμονικές διαταραχές, όπως μεταβολή της αναλογίας του φύλου (sex ratio) και σημαντική αλλαγή των επιπέδων της βιτελλογενίνης στο πλάσμα ή το ήπαρ των ιχθύων. Πραγματοποιήθηκαν εκτροφές τσιπούρας (Sparus aurata) και λαβρακιου (Dicentrarchus labrax) σε δύο όμοια, κυκλώματα θαλασσινού νερού με επανακυκλοφορία (Recirculating Aquaculture System). Η σύσταση των πειραματικών ιχθυοτροφών τροφών περιγράφεται στο Π.2.1. και οι συνθήκες της κάθε εκτροφής παρουσιάζονται στο Π.2.2 Για την ανίχνευση και τον ημιποσοτικό προσδιορισμό βιτελλογενίνης στο πλάσμα των ιχθύων της πειραματικής εκτροφής, χρησιμοποιήθηκε μέθοδος είναι μέθοδος ELISA.
Τα αποτελέσματα (Π.3.4.) έδειξαν ότι στα άτομα τσιπούρας εμφανίζονται στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα βιτελλογενίνης μόνο στα άτομα με μεγαλύτερο αρχικό σωματικό βάρος (εκτροφή L). Αντίθετα στα λαβράκια δεν παρατηρούνται στατιστικά σημαντικές διαφορές των επιπέδων βιτελλογενίνης μεταξύ των χειρισμών ανεξαρτήτως του εμπλουτισμού με φυτικά έλεια ή ιχθυέλαιο. Στο παρόν παραδοτέο, παρουσιάζεται αναλυτικά η αποτίμηση της επίδρασής των Φ.Ο. και η σχέση των διατροφικών επιπέδων ΦΟ με τα επίπεδα βιτελλογενίνης στο πλάσμα του αίματος, τα οποία δείχνουν να εξαρτώνται από το είδος που εκτρέφεται και τη φάση ανάπτυξης των ιχθύων. Στην τσιπούρα η περιεκτικότητα σε φυτοοιστρογόνα της τροφής που παρέχεται εμφανίζει οιστρογονικότητα σε πιο ανεπτυγμένα άτομα. Αντίθετα, στο λαβράκι, τα φυτοοιστρογόνα που περιέχονται στη τροφή δεν φαίνεται να έχουν οιστρογονική δράση, καθώς τα επίπεδα της βιτελλογενίνης παραμένουν χαμηλά. Παρατηρείται μια μικρή διαφοροποίηση των τιμών που θα μπορούσε να αποδοθεί σε οιστρογονικής δράση των φυτοστερολών οι οποίες περιέχονται στα φυτικά έλαια, τα αποτελέσματα όμως της επίδρασης δεν είναι σαφή λόγω του νεαρού των ιχθύων που χρησιμοποιήθηκαν στην εκτροφή. Από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας φαίνεται ότι η μέτρηση των επιπέδων βιτελλογενίνης είναι ένας σημαντικός βιοδείκτης οιστρογονικής δραστηριότητας στα ψάρια ιχθυοκαλλιεργειών αλλά η δράση και τα αποτελέσματα της εξαρτώνται από το είδος, το βιολογικό κύκλο και το στάδιο ανάπτυξης των ιχθύων.