Tα αποτελέσματα του έργου θα είναι διαθέσιμα δωρεάν για όλες τις επιχειρήσεις που δραστηριοποιούνται στον συγκεκριμένο τομέα.
Η υλοποίηση του έργου περιλαμβάνει 4 κύριες δραστηριότητες που αναλύονται συνοπτικά ακολούθως.
Ανάπτυξη Μεθοδολογίας. Αποτελεί το 1ο στάδιο υλοποίησης και αναφέρεται σε τρία πεδία εφαρμογής:
Το 1ο πεδίο αφορά την ανάπτυξη νέας προηγμένης μεθόδου για τον ποσοτικό προσδιορισμό και την ταυτοποίηση ΦO με UPLC-MS/MS.
Τα πειράματα θα διεξαχθούν με σύστημα υγρής χρωματογραφίας εξαιρετικά υψηλής απόδοσης (Ultra-Performance Liquid Chromatography) συζευγμένο με φασματόμετρο μαζών με τριπλό τετράπολο (TSQ Quantum Access, Thermo). Αρχικά για κάθε ένα από τα πρότυπα ΦΟ θαδιάφορες συγκεντρώσεις και έλεγχος των ελαχίστων ορίων ανίχνευσης. Θα ακολουθήσει ενσωμάτωση των δεδομένων και δημιουργία βιβλιοθήκης φασμάτων που θα επιτρέπει τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό ΦΟ.
Το 2ο πεδίο αφορά την ανάπτυξη εύχρηστων μεθόδων ανίχνευσης ΦΟ.
Θα αναπτυχθούν απλές χρωματογραφικές μέθοδοι (όπως HPLC με ανιχνευτές UV, DAD, Fluorescent, Electrochemical) που θα επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό μικρού αριθμού γνωστών ΦΟ.
To 3ο πεδίο αφορά στην ανάπτυξη μεθόδου διερεύνησης της οιστρογονικής δράσης των ΦΟ στην τσιπούρα και το λαβράκι.
Θα αναπτυχθεί μέθοδος ELISA για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό βιτελλογενίνης στο πλάσμα των ιχθύων της πειραματικής εκτροφής.
Πειραματική Εκτροφή. Θα πραγματοποιηθεί εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού με ιχθυοτροφές, στις οποίες θα έχει γίνει μερική αντικατάσταση του ιχθυαλεύρου και ιχθυελαίου με φυτικές πρώτες ύλες. Θα εκτιμηθούν παράμετροι ανάπτυξης και φυσιολογίας των ιχθύων. Θα λαμβάνονται δείγματα ιστών και πλάσματος για αναλύσεις στο πλαίσιο του εργαστηριακού πειραματισμού.
Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων. Είναι το 4ο και καταληκτικό στάδιο και αναφέρεται:
1) στη σύγκριση μελετώμενων μεθόδων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης ΦΟ με τις ήδη υπάρχουσες στη βιβλιογραφία.
2) στον εντοπισμό δευτερογενών μεταβολιτών στα άλευρα και τα έλαια που είναι πλούσια σε ΦΟ που θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως markers για την ανίχνευση των αλεύρων και των ελαίων αυτών σε ιχθυοτροφές. Ο πιθανός εντοπισμός θα προκύψει από τη μελέτη της βιβλιογραφίας και των αποτελεσμάτων των προηγούμενων δραστηριοτήτων.
ΕΕ1. Ανάπτυξη μεθοδολογίας. Διάρκεια: 1-36 μήνες
Στην ενότητα αυτή θα αναπτυχθεί μέθοδος για τον προσδιορισμό και την ταυτοποίηση του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού ΦO με UPLC/MS-MS όσο και εύχρηστες μέθοδοι που θα επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πλέον γνωστών ΦΟ.
Παραδοτέα
Π.1.1: Βιβλιοθήκη φασμάτων UPLC-MS/MS των ΦΟ.
Π.1.2: Μέθοδος (UPLC-MS/MS) με την οποία θα μπορούν ταυτοποιηθούν και να προσδιοριστούν ποσοτικά ΦΟ.
Π.1.3: Μέθοδοι που επιτρέπουν την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των πλέον γνωστών ΦΟ.
Π.1.4: Μέθοδος (ELISA) προσδιορισμού της βιτελλογενίνης στο πλάσμα ιχθύων.
ΕΕ2. Πειραματική Εκτροφή. Διάρκεια: 3-36 μήνες
Θα πραγματοποιηθεί εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού, σε πρώτη φάση με τρεις εμπορικές τροφές, που θα διαφοροποιούνται ως προς τις εναλλακτικές πηγές πρωτεΐνης και λίπους για τη μερική αντικατάσταση του ιχθυάλευρου και του ιχθυελαίου. Θα χρησιμοποιηθούν τροφές που θα περιέχουν συνδυασμούς αλεύρων σόγιας και ελαιοκράμβης καθώς και ελαίου ελαιοκράμβης. Σε δεύτερη φάση, θα γίνει εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού με σιτηρέσια, που θα έχουν διαφορετικές συγκεντρώσεις ΦΟ εκμεταλλευόμενοι τα αποτελέσματα της πρώτης φάσης. Θα εκτιμηθούν χαρακτηριστικά της ανάπτυξης των ιχθύων, όπως ειδικός ρυθμός αύξησης βάρους, συντελεστής εκμετάλλευσης της τροφής, ηπατοσωματικός δείκτης και συντελεστής ευρωστίας Στο πλάσμα του αίματος θα προσδιοριστούν τριγλυκερίδια, ολική χοληστερόλη, LDL & HDL. Στο ήπαρ και στο φιλέτο θα μετρηθεί η περιεκτικότητα σε λίπος. Δείγματα ιστών και πλάσματος θα παραληφθούν για αναλύσεις στο πλαίσιο του πειραματικού σχεδιασμού.
Παραδοτέα
Π.2.1: Σύσταση πειραματικών ιχθυοτροφών.
Π.2.2: Χαρακτηριστικά ανάπτυξης των ιχθύων.
Π.2.3: Επίπεδα λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών στο πλάσμα των ιχθύων.
Π.2.4: Περιεκτικότητα σε λίπος του ήπατος και φιλέτου των ιχθύων.
Π.2.5: Παραλαβή δειγμάτων ήπατος και φιλέτου για ανάλυση ΦΟ.
Π.2.6: Παραλαβή δειγμάτων πλάσματος για ανάλυση βιτελλογενίνης.
ΕΕ3. Εργαστηριακός Πειραματισμός. Διάρκεια: 1-38 μήνες
Στο τρίτο στάδιο εντάσσονται, τόσο οι εκχυλίσεις σε άλευρα, έλαια και ιχθυοτροφές όσο και σε ιχθύς. Στις ιχθυοτροφές θα συμπεριλαμβάνονται και οι τροφές που θα χρησιμοποιηθούν για την εκτροφή (ΕΕ2). Θα ακολουθήσει η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των ΦΟ με την τεχνική UPLC-MS/MS (στο σύνολο των εκχυλισμάτων) και τις εύχρηστες τεχνικές (σε προεπιλεγμένα εκχυλίσματα αλεύρων, ελαίων και ιχθυοτροφών). Με την ίδια μεθοδολογία (UPLC-MS/MS) θα μελετηθούν και τα εκχυλίσματα ιστών ιχθύων.
Παραδοτέα
Π.3.1: Συγκριτική μελέτη απόδοσης μεθόδων εκχύλισης ΦΟ και συσχετισμός με τις αντίστοιχες μελέτες της βιβλιογραφίας.
Π.3.2: Αναλύσεις ΦΟ σε ιχθυοτροφές και πρώτες ύλες. Έκθεση αποτελεσμάτων.
Π.3.3: Αναλύσεις ΦΟ σε ήπαρ και φιλέτο ιχθύων. Έκθεση αποτελεσμάτων.
Π.3.4: Αναλύσεις βιτελλογενίνης σε πλάσμα ιχθύων. Έκθεση αποτελεσμάτων.
ΕΕ4. Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων. Διάρκεια: 1-40 μήνες
Η ενότητα αυτή αφορά στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των προηγούμενων ΕΕ και τη σύγκριση με βιβλιογραφικά δεδομένα. Στην ΕΕ1 εντάσσεται η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά με δημοσιευμένες μεθόδους που έχουν αναπτυχθεί για την ανάλυση ΦΟ σε συγγενή υποστρώματα. Η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας στην ΕΕ2 αφορά την επίδραση των ΦΟ στην ανάπτυξη και το μεταβολισμό του λίπους των ιχθύων και στην ΕΕ3 τα αποτελέσματα ανάλυσης ποικιλίας υποστρωμάτων σε ΦΟ Η σύνδεση των προηγούμενων ΕΕ θα επιτρέψει τη διεξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με τη συγκράτηση των ΦΟ στους ιστούς τσιπούρας και λαβρακιού, καθώς και με την οιστρογονική τους δράση.
Παραδοτέα
Π.4.1: Βιβλιογραφική ανασκόπηση μεθόδων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης ΦΟ.
Π.4.2: Σύγκριση μελετώμενων μεθόδων ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης ΦΟ.
Π.4.3: Πιθανός εντοπισμός δευτερογενών μεταβολιτών ως markers.
Π.4.4. Επίδραση των διατροφικών ΦΟ στην ανάπτυξη και τον μεταβολισμό του λίπους των ιχθύων.
Π.4.5: Συγκράτηση διατροφικών ΦΟ σε ιστούς εκτρεφόμενων ιχθύων.
Π.4.6: Σχέση επιπέδων διατροφικών ΦΟ και επιπέδων βιτελλογενίνης στο πλάσμα των ιχθύων.